Electrochemical Biosensors for Triglycerides Detection Based on the Use of the Enzyme Lipase

 

Ana K. Perez¹, Anna Iliná*¹, José Sandoval², María A. Zon³, Fernando J. Arévalo³, Elda P. Segura¹, José L. Martinez¹, Rodolfo Ramos¹, Edith M. Colunga², Raúl G. López⁴, Héctor Fernández³

¹Cuerpo Académico (CA) de Nanobiociencia, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Boulevard V. Carranza y José Cárdenas Valdés, 25280, Saltillo, Coahuila, México. Tel. y Fax: (52) 844 4159534. *Correo electrónico:anna_ilina@hotmail.com

²CA de Química Analítica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Autónoma de Coahuila, Boulevard V. Carranza y José Cárdenas Valdés, 25280 Saltillo, Coahuila, México.

³Departamento de Química, Grupo de Electroanalítica (GEANA), Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, Agencia Postal N 3, (5800), Río Cuarto, Argentina.

⁴Departamento de Procesos de Polimerización, Centro de Investigación en Química Aplicada, Boulevard Enrique Reyna No. 140, 25294, Saltillo, Coahuila, México.

 

Artículo PDF

Resumen

 

El desarrollo de biosensores basados en el uso de lipasas es de suma importancia en el área clínica, biotecnología ambiental, industria de alimentos, control y desarrollo de los procesos de obtención de biodiesel, etc. El presente artículo describe fundamentos enzimáticos y electroquímicos aplicados al diseño de biosensores para la detección de triglicéridos, cimentados en el uso de enzimas lipasas inmovilizada en diferentes soportes. Además, basándose en las propias experiencias, se demuestra que el concepto de utilizar las lipasas para generar glicerol a partir de los triglicéridos y cuantificar el glicerol liberado mediante un sistema nanoestructurado que incluye el uso de metales y sus óxidos como catalizadores de oxidación electroquímica de glicerol, es muy prometedor.

Palabras clave: Lipasas, biosensor, detección electroquímica, inmovilización, sistema nanoestructurado.

Abstract

The development of biosensors based on the use of lipases is of utmost importance in the clinical area, environmental biotechnology, food processing, control, development of biodiesel production processes, etc. This article describes the enzymatic and electrochemical basis of biosensor design applied to triglyceride detection based on the use of lipases immobilized on different carriers. Moreover, on the basis of our own experiences, it is shown that the concept of using lipases to produce glycerol from triglycerides and the quantification of the released glycerol by a nanostructured system, which includes the use of metals or their oxides as catalysts for the electrochemical oxidation of glycerol, is very promising.

Keywords: Lipases, biosensor, electrochemical detection, immobilization, nanostructured system.

INTRODUCCIÓN

Un biosensor consiste en un dispositivo compacto de análisis que incorpora un elemento de reconocimiento biológico (ácido nucléico, enzima, anticuerpo, receptor, tejido, célula) asociado a un sistema de transducción que permite procesar la señal producida por la interacción entre el elemento de reconocimiento y el analito (Pumera  y col., 2007). En la Figura 1 se muestra el esquema correspondiente a un biosensor. El principio de detección de un biosensor se basa en la interacción específica entre el compuesto o analito de interés y el elemento biológico de reconocimiento. Como resultado de esta unión se produce la variación de una o varias propiedades físico-químicas (pH, transferencia de electrones, de calor, cambio de potencial, de masa, variación de las propiedades ópticas, etc.) que detecta el transductor. Este sistema transforma la respuesta del elemento de reconocimiento en una señal eléctrica indicativa de la presencia del analito sometido a estudio o proporcional a su concentración en la muestra (Zhao y Jiang, 2010).

El desarrollo de biosensores para la detección de triglicéridos basados en el uso de lipasas es de suma importancia en el área clínica, biotecnología ambiental, industria de alimentos, control y desarrollo de los procesos de obtención de biodiesel, etc. (Reddy y col., 2001).Las lipasas (E.C. 3.1.1.3) son enzimas que actúan mediante la hidrólisis de los enlaces ésteres carboxílicos de los triglicéridos para formar ácidos grasos y glicerol.Es bien conocido, por ejemplo, que un nivel alto de triglicéridos puede llevar a arterosclerosis, lo cual incrementa el riesgo de ataque cardíaco y accidente cerebrovascular y también puede causar inflamación del páncreas. Las personas con niveles de triglicéridos altos a menudo tienen otras afecciones, como diabetes y obesidad, que también incrementan las posibilidades de desarrollar cardiopatías  (Millán y col., 2013).

En el presente artículo de revisión se pretende analizar el estado actual del desarrollo de biosensores electroquímicos para la detección de triglicéridos, basados en el uso de las enzimas lipasas.

Lipasas como catalizadores biológicos

Las lipasas (triacilglicerollacilhidrolasas, EC 3.1.1.3) son parte de la familia de las hidrolasas que actúan sobre los enlaces carboxílicos. Su rol fisiológico es hidrolizar los triglicéridos a diglicéridos, monoglicéridos, ácidos grasos y glicerol. Así mismo, pueden llevar a cabo la esterificación, interesterificación y transesterificación en medios no acuosos (Xie y Wang, 2012).

Estas enzimas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se encuentran en microorganismos, plantas y animales (Hasan y col., 2006). Las lipasas comercialmente útiles se obtienen, generalmente, a partir de microorganismos, debido al bajo costo de producción, una mayor estabilidad y mayor disponibilidad en comparación con las lipasas vegetales y animales. Las lipasas difieren en varias de sus propiedades (estructura primaria, peso molecular de 22 a 60 kDa, selectividad, actividad, termoestabilidad y pH óptimo de la reacción) dependiendo de su origen, sin embargo, todas las lipasas muestran una alta especificidad sobre los sustratos (Gao y col., 2011).

Los microorganismos con un alto potencial para producir lipasas pueden ser encontrados en diferentes hábitats, principalmente en desechos o residuos de aceites vegetales empleados en la elaboración de frituras, industrias de productos lácteos, suelos contaminados con aceites y alimentos deteriorados. Lo anterior indica que el mismo ambiente natural ofrece un amplio potencial para proporcionar nuevas fuentes de lipasas con propiedades novedosas (Singh y Mukhopadhyay, 2012). A partir de éstos nichos se han aislado bacterias, hongos filamentosos, levaduras y actinomycetos, entre los que sobresalen los géneros Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Staphylococcus, Rhizopus, Mucor, Candida, Aspergillus y Geotrichumsp (Hasan y col., 2006). Dado que las lipasas se encuentran entre las enzimas más ampliamente utilizadas en procesos biotecnológicos y químicos, la investigación se ha enfocado en la búsqueda de nuevos microorganismos con diferentes propiedades lipolíticas deseadas. Los hongos filamentosos son reconocidos como los mejores productores de lipasas debido a su capacidad de producir lipasas extracelulares, facilitando la recuperación de estas enzimas a partir del medio de cultivo (Singh y Mukhopadhyay, 2012). Las especies más estudiadas pertenecen a los géneros Rhizopus sp., Mucor sp., Geotrichum sp., Penicillium sp. Y Aspergillus sp. (Lianghuay col., 2007; Contesiniy col., 2010; Kantaky col., 2011).

Se ha encontrado que la mayoría de las lipasas comparten una estructura común, un plegamiento de polipéptidos compuesto por 8 láminas β, conectadas por 6 α-hélices (Bornscheuery col., 2002). Una importante cualidad de las lipasas es que la triada catalítica Ser-His-Asp/Glu, está cubierta completamente por una tapa o “lid” que debe estar completamente abierta para acceder al sustrato. Esta triada catalítica está unida en una región consenso Gly–X-Ser-X-Gly (Jaeger, 2002). Por lo tanto, las lipasas pueden existir en dos formas. Una de ellas es el centro activo de la lipasa que está protegido por una cadena polipeptídica que forma un segmento helicoidal llamado “lid”. Bajo esta forma, se dice que la enzima está inactiva (forma cerrada). En la forma abierta o activa, la cadena polipeptídicase desplaza y el centro activo se expone al medio de reacción. En una solución acuosa, las lipasas pueden existir en equilibrio entre las dos formas. Este intercambio entre la forma cerrada y abierta de la enzima provista por la interfase agua-aceite, está acompañada por cambios conformacionales (Thomas y col., 2005).

 

Figura1: Esquema de una biosensor

 

Figura 2: Diagrama de mecanismo de reacción catalizada por la lipasa

 

Se ha demostrado que muchas de las lipasas tienden a formar agregados moleculares, por adsorción de la forma abierta de la lipasa, mediada por la hidrofobicidad del centro activo. Estos agregados presentan diferentes propiedades catalíticas cuando se comparan con una molécula individual (Zhang y col., 2013).

El mecanismo de reacción de las lipasas es común para todos los miembros de la familia “serina hidrolasas” (Fig.2).  El sitio activo de las lipasas está formado por una triada catalítica consistente de los aminoácidos serina, histidina y ácido aspártico o glutámico. El paso inicial del mecanismo de reacción consiste en la formación de un complejo enzima–sustrato, en el cual la región de la molécula que será hidrolizada es estabilizada en la cavidad catalítica por varios puentes de hidrógeno (Fig.2). La reacción es entonces iniciada por el ataque nucleofílico por parte de grupos hidroxilo de la serina sobre los átomos de carbonilo del enlace éster, resultando en la formación de un intermediario covalente tetraédrico. La estabilización de este estado de transición es reforzada por dos puentes de hidrógeno sobre los oxígenos negativamente cargados u oxianiones presentes en el sustrato. Un protón es entonces transferido de la cadena lateral de la serina al grupo que es entonces liberado como el primer producto de reacción, un alcohol (R-OH).

El complejo covalente que involucra a la enzima y al sustrato retenido es llamado el complejo covalente acil-enzima. La acilación, por ejemplo, la formación de la acil enzima, es entonces seguida por reacciones de desacilación, lo cual conduce a la liberación de un segundo producto, un ácido graso, y a la regeneración de la enzima en su forma original.La desacilación involucra un proceso análogo a la acilación. Una molécula de agua actúa como el nucleófilo y ataca al grupo carbonilo de la acil-enzima. Se forma un segundo intermediario tetraédrico y, entonces, se desprende el complejo enzima-producto, el cual es separado por una simple disociación. El ácido carboxílico y los residuos de histidina de la triada llegan a involucrarse, haciendo al grupo hidroxilo de la serina un nucleófilo fuerte y, de esta manera, un catalizador altamente reactivo. Ambos, los residuos de ácido carboxílico y serina están ligados a la histidina por puentes de hidrógeno (Zhang y col., 2013).

Las lipasas desarrollan un mecanismo de acción muy singular, llamado activación interfacial: cuando la lipasa se encuentra en un medio polar, el segmento helicoidal o “lid” se encuentra cerrado. Esto provoca que la enzima esté protegida y solamente pueda llegar a actuar en la interfase agua-aceite generada por una emulsión (Gaoy col., 2011).

De manera general, las lipasas son enzimas que requieren de activación interfacial para desplegar al máximo su actividad catalítica (Thomas y col., 2005). Se entiende por interfase a la superficie imaginaria del espacio que separa dos porciones homogéneas y distintas físicamente. A nivel molecular, una interfase consiste en un conjunto de dos capas adyacentes de moléculas ordenadas con diferente carácter hidrofóbico–hidrofílico(González-Bancerioy col., 2010). Cuando la enzima entra en contacto con una interfase, el ambiente dieléctrico en la superficie protéica se modifica, en el sentido de potenciar las interacciones electrostáticas. Esto facilita que la cubierta del centro activo se desplace (Foresti y Ferreira, 2004), y se produce una reestructuración en la conformación de la molécula (Aloulouy col., 2006; Liny col., 2007). Como resultado, los aminoácidos catalíticos quedan expuestos al solvente en una orientación adecuada, y alrededor de éstos se conforma la cavidad oxianiónica, por exposición de determinados residuos hidrofóbicos e internalización de otros hidrofílicos. Todo esto incrementa la afinidad de la enzima por sus sustratos lipídicos y contribuye a la estabilización del estado de transición durante el ciclo catalítico (Mead y col., 2002).

Inmovilización de lipasas para las aplicaciones biotecnológicas

La inmovilización es una paso clave en la aplicación de lipasas en los procesos biotecnológicos, incluso en el diseño de biosensores (Zhao y Jiang, 2010). La inmovilización significa la asociación de los biocatalizadores con una matriz insoluble, de tal manera que se puedan retener para su reutilización (Dsouza, 1999). Además, la inmovilización a menudo ayuda a incrementar la estabilidad de las enzimas. La estabilidad de la enzima en el biosensor es un aspecto importante.

El método de inmovilización aplicado en el diseño de biosensor depende del elemento biológico de reconocimiento, el tipo de transductor, las propiedades fisicoquímicas del analito y las condiciones de operación. La selección inadecuada de técnicas de inmovilización, puede causar daños en la conformación de las biomoléculas, llevando a la inactivación de éstas (Aryay col., 2008).

Los métodos de inmovilización incluyen adsorción y atrapamiento (técnicas físicas), así como unión covalente y entrecruzamiento (técnicas de inmovilización química). En las Tablas 1 y 2 se indican algunos informes sobre la inmovilización de las enzimas lipasas para ser usadas en diversas industrias (oleoquímica, alimentaria, textil, entre otras), así como en el diseño de biosensores.

Xie y Ma (2009) informaron sobre la inmovilización de la lipasa en nanopartículas magnéticas funcionalizadas  con 3-aminopropiltrietoxisilano. El soporte con grupos amino fue activado con glutaraldehído. El derivado inmovilizado tuvo más del 70 % de recuperación de la actividad y una eficiencia de enzima inmovilizada del 84 %. Por otra parte, Xie y Wang (2012) informaron sobre la inmovilización de la lipasa de Candida rugososaen microesferas magnéticas recubiertas con quitosán. El preparado inmovilizado fue utilizado en la síntesis de biodiesel a partir del aceite de soya, alcanzando conversiones de triglicéridos del 87 %, y teniendo una reutilización del preparado inmovilizado en 4 ciclos sin una pérdida significativa de actividad.

Silva y col. (2012) publicaron los resultados sobre la inmovilización de la lipasa de Candida antárctica en quitosán y un complejo de quitosán-alginato (Tabla 1). Utilizaron como agentes activadores: glicidol, etilendiamina, glutaraldehído y sus combinaciones. El mejor derivado (quitosán-alginato activado con la combinación de todos) mostró una máxima actividad de 422 ± 50 U/g de soporte, presentando buenos resultados en cuanto a estabilidad térmica y operacional.

Recientemente,Xie y Wang (2014) inmovilizaron la lipasa de Candida rugososaen microesferas de un compósito magnético con poli (estireno-ácido metacrílico), activado con 1-etil-3-(3 – (dimetilamino) propil) carbodiimida para la formación de unión covalente entre el soporte y la enzima. Se encontró que la conversión de aceite alcanzó niveles del 86% a una temperatura de reacción de 35 °C durante 24 h. La lipasa inmovilizada mantuvo su actividad en cuatro ciclos de uso repetido.

Los resultados obtenidos por nuestro grupo de trabajo (Osuna y col., 2015) demuestran que la lipasa de Aspergillus niger puede ser inmovilizada en las nanopartículas recubiertas con quitosán, las cuales fueron obtenidas mediante la co-precipitación en un único paso (Osuna y col. 2012).  Se compararon las propiedades de los preparados obtenidos mediante la activación del soporte con glicidol y aldehído glutárico para la formación del enlace covalente.  En la Fig. 3 se presentan los esquemas de activación correspondientes a ambos sistemas. Se observó que, mediante la inmovilización con glutaraldehído, la actividad y estabilidad de la enzima fueron mayores que en el caso de glicidol (Tabla 1).

 

 

 Figura 3. Esquemas de las reacciones de activación de quitosán con aldehído glutárico (arriba) y glicidol (abajo).

 

Ambos preparados fueron activos durante más de 15 ciclos de aplicación en la transformación del sustrato. Además, el preparado inmovilizado mediante el uso de gluteraldehído se caracterizó por una disminución de la constante de Michaelis (K_m) en 1.7 veces. El efecto similar de inmovilización de lipasa se reportó por Ranjbakhsha y col. (2012), quienes explicaron el efecto observado por los cambios conformacionales que favorecen la afinidad entre la enzima y el sustrato.

Biosensores electroquímicos

En los últimos años, los biosensores electroquímicos son los que más publicaciones científicas han generado (Ben Rejeby col., 2007; Wang y col., 2008; Maruta y Paixão, 2012). Esto es debido a que su fabricación es más simple y económica que la del resto de los biosensores, además, poseen un amplio intervalo de linealidad y tiempos de respuesta muy cortos. De la misma manera, los equipos necesarios para recoger y procesar la señal, tales como potenciostatos y conductímetros, son económicos, de fácil mantenimiento, manejo y miniaturización, y son de uso común en la mayoría de los laboratorios de análisis (Pohanka y Skládal, 2008).

Existen tres grupos de biosensores electroquímicos clasificados según la técnica electroquímica utilizada para obtener la información de la muestra: conductimétricos, potenciométricos y amperométricos (Grieshabery col., 2008).

Los biosensores conductimétricos se basan en la medida de cambios de conductividad provocados por el analito, ya sea en la solución de medida o en la membrana selectiva. Las medidas de resistividad en corriente alterna, son las más comunes para el funcionamiento de estos biosensores. Estos dispositivos tienen una configuración muy simple que consiste en dos electrodos que pueden ser de diferentes materiales (Okafory col., 2008).

Los biosensores potenciométricos consisten en la determinación de una diferencia de potencial en condiciones de circuito abierto entre un electrodo de trabajo y uno de referencia. La diferencia de potencial medida entre los electrodos se relaciona con la concentración del analito (Shiny col., 1998).

Los biosensores amperométricos se basan en la aplicación de un potencial fijo sobre un electrodo de trabajo, generalmente de platino, oro o grafito, respecto a un electrodo de referencia. Un tercer electrodo, denominado auxiliar, es necesario en la mayoría de casos para completar la celda electroquímica (Prodromidis y Karayannis, 2002). También es posible realizar análisis basados en técnicas voltamperométricas, variando el potencial de trabajo de forma controlada. Los biosensoresamperométricos se fundamentan en la proporcionalidad que existe entre la concentración de una determinada especie electroactiva y la corriente eléctrica registrada al oxidarse o reducirse ésta sobre la superficie de un electrodo polarizado (Sangam y Patre, 2006). Los biosensores amperométricos son los que han mostrado mayor avance debido a su extensa aplicación dentro del campo de análisis médico (Belluzoy col., 2008).

Estudios recientes han demostrado que los nanotubos de carbono (NTC) poseen una gran actividad electrocatalítica y pueden ser aplicados en el diseño de biosensores. Los NTC tienen propiedades únicas que los hacen muy atractivos para ser aplicados en sensores químicos en general y, en la detección electroquímica, en particular (Liuy col., 2012). Tienen la capacidad de transportar electrones, pueden actuar con características metálicas o semiconductoras y también tienen una alta resistencia mecánica y flexibilidad (Castranovay col., 2012).

Los NTC pueden ser fabricados mediante deposición química, métodos de arco de carbono o evaporación laser (Praseky col., 2011). De acuerdo al número de capas, se dividen en nanotubos de pared simple (NTCPS) o de pared múltiple (NTCPM). Los NTCPS  son los que se pueden describir como una capa bidimensional de grafito “enrollada”, formando un cilindro de décimas de micrones de longitud y radio del orden de los nanómetros, los cuales, además, poseen en sus extremos semiestructuras de fullerenos (tercera forma molecular de carbono). Los NTCPM son aquellos formados por capas concéntricas de forma cilíndrica, las cuales están separadas aproximadamente por una distancia similar a la distancia interplanar del grafito (Baughmany col., 2002).

Una detección electroquímica mejorada del citocromo C (Wang y col., 2002a), del ácido ascórbico y dopamina (Wangy col., 2002b), así como de las hidracinas (Zhaoy col., 2002) ha sido reportada para los electrodos modificados con NTC. La capacidad de los NTC de promover las reacciones de transferencia electrónica del NADH y del peróxido de hidrógeno es prometedora para los biosensores amperométricos basados en enzimas deshidrogenasas (Zhangy col., 2004; Tsaiy col., 2007).

La inclusión de NTC en sensores electroquímicos para llevar a cabo la cuantificación de analitos, como compuestos nitroaromáticos (Yang y col., 2012), fármacos (Jainn ySharma, 2012), pesticidas y antibióticos (Cesarinoy col., 2012; Moraesy col., 2013), antioxidantes (Granero y col., 2010), entre otros, ha demostrado grandes ventajas, ya que ayuda a incrementar la respuesta y, por ende, la sensibilidad. Además, en ocasiones, ayuda inclusive a la separación de las señales de los interferentes (Rodríguez y col., 2008).Los electrodos modificados con NTC se basan en el agregado de una disolución de NTC/ácido sulfúrico sobre la superficie de un electrodo de carbono vítreo(Zhaoy col.,2002), un procedimiento que no es compatible con la inmovilización de biocomponentes. Por ello, hay una gran necesidad de desarrollar nuevos procedimientos de fabricación para ampliar las aplicaciones de los biosensores electroquímicos basados en NTC (Boeroy col., 2012).

Estudios recientes demuestran que los NTC pueden mejorar la reactividad electroquímica de diversas biomoléculas y pueden promover las reacciones de transferencia de electrones (Valentiniay col., 2004; Balasubramanian y Burghard, 2006). Además, los electrodos modificados con NTC han sido útiles para acumular biomoléculas y para evitar problemas de contaminación de la superficie. La notable conductividad de los NTC colocados sobre la superficie permite el uso de éstos como sensores con sensibilidades a nanoescala. Estas propiedades hacen de los NTC, un material muy atractivo para la preparación de electrodos enzimáticos amperométricos (Grieshabery col., 2008).

Electrodos para la detección electroquímica de triglicéridos

Los prototipos de los electrodos diseñados para la detección de triglicéridos (Tabla 2), comúnmente comprenden la detección del cambio de pH en la reacción de hidrólisis o la detección de glicerol. Ellos se basan en un sistema que implica la co-inmovilización de las enzimas lipasa-deshidrogenasa NADH dependiente, así como las enzimas lipasa-glicerol quinasa y la glicerol-3-fosfato-oxidasa, determinando electroquímicamente el consumo de NADH y el peróxido de hidrógeno producido, respectivamente, en las reacciones acopladas, demostrando una gran variedad de los métodos de inmovilización de las enzimas, soportes y su introducción en el sistema electroquímico(Reddyy col., 2001; Ganjaliy col., 2010; Pundiretaly col., 2010; Hossainy col., 2010).  Estos sensores presentan desventajas, tales como cambios en la precisión al cambiar el tipo de muestra, número de ciclos de uso limitados y tiempo de vida media corto. A su vez, los sensores basados en los cambios de pH no son exactos y los que emplean el conjunto de enzimas descrito implican mucho trabajo en la elaboración del sensor. Otros trabajos relacionados con el tema de biosensores para la detección de triglicéridos se indican en la Tabla 2.

La inmovilización es un procedimiento importante para el diseño de un biosensor y es la base para lograr la interfaz entre el elemento biológico y el sistema de transducción (Tabla 2). Los biosensores son casi siempre diseñados con alta carga de enzima, para asegurar una suficiente actividad catalítica (Zhao y Jiang, 2010). Además, la estabilidad de la enzima en el biosensor es un aspecto importante, por lo que las enzimas se fijan a un soporte sólido.

Los biosensores basados en sistemas nanométricos (Tabla 2) tienen una excelente proyección a futuro como una nueva generación de dispositivos bioelectrónicos con alta sensibilidad y estabilidad (Li y col., 2009; Arévalo y col., 2011; Arévalo y col., 2012; Perrotta y col., 2012; Foroughi y col., 2014).

Los nanomateriales han sido usados para lograr una conexión directa de las enzimas a la superficie del electrodo, también para promover la reacción electroquímica y, además, para amplificar la señal de reconocimiento (Pumera y col., 2007).

Los sistemas nanoestructurados pueden tener gran auge en la detección electroquímica de triglicéridos, mediante la oxidación del glicerol generado en la reacción catalizada por la enzima lipasa (Tabla 2). La oxidación de glicerol puede llevarse a cabo electroquímicamente mediante el empleo de metales y/o nanopartículas metálicas. Se informó que es posible oxidar el glicerol tanto sobre electrodos de platino como sobre electrodos de carbono con platino nanoparticulado (Fernandesy col., 2012; Fernández y col., 2012). El empleo de paladio para la catálisis de la oxidación de glicerol también ha mostrado buenos resultados. Además, en este caso, la inclusión de metales como el oro y el niquel mejoran la respuesta en términos de la densidad de corriente obtenida (Simoes y col., 2010).

Un método rápido, basado en la electrooxidación del glicerol sobre electrodos de platino, mediante la técnica de barrido de potencial cíclico, fue desarrollado para la determinación de glicerol libre en biodiesel (Lourenco y Stradiotto 2009).

Con respecto al empleo de metales que abaraten el costo en la construcción de un sensor se puede emplear níquel, ya que ha demostrado ser eficiente en la oxidación electroquímica de glicerol. Éste fue empleado para la cuantificación de glicerol en muestras de biodiesel logrando respuestas lineales en un intervalo de concentraciones que va desde 0.5 hasta 12 mM y una sensibilidad de 2.68 mA mM^-1 (Tehrani yAb Ghani, 2012). Otra opción es el empleo de cobre que ha sido incluido en celdas de análisis por inyección en flujo para la cuantificación de glicerol en serie de muestras de biodiesel (Maruta yPaixão, 2012).

Los resultados reportados por nuestro grupo de trabajo (Tabla 2) se basan en los ensayos que engloban las novedosas experiencias que se tiene en el ámbito del manejo de las lipasas y las técnicas electroquímicas de oxidación de glicerol con metales (Osuna y col. 2013; Osuna Sánchez, 2013; Osuna Sánchez y col., 2014).

Se estudiaron dos lipasas fúngicas provenientes de Aspergillus niger: una enzima fue comercial (Sigma-Aldrich^®) y la otra fue producida mediante fermentación a partir de A. niger,proveniente del semi-desierto de Coahuila, comparando así las características operacionales de ambas preparaciones enzimáticas (Osuna Sánchez, 2013). Las lipasas fueron inmovilizadas en nanopartículas magnéticas recubiertas con quitosán y activadas con dos agentes: glutaraldehído y glicidol. En ambos casos, la activación condujo a la formación de grupos aldehídos, para su posterior interacción con grupos amino de la enzima. Sin embargo, en el caso del glutaraldehído, la modificación se efectúa a través de los grupos amino del quitosán, mientras que el glicidol modifica los grupos hidroxilo del polisacárido. Estudios tales como el análisis infrarrojo, termogravimétrico y microscopía electrónica de barrido y de transmisión, así como la determinación de proteínas y los rendimientos de inmovilización confirmaron la interacción de los soportes activados con la enzima, logrando una inmovilización exitosa. Los mayores rendimientos y actividades enzimáticas se obtuvieron con el soporte activado con glutaraldehído, tanto para la enzima producida a partir del hongo, así como para la comercial. Además, la inmovilización mejoró la estabilidad de la enzima contra cambios de pH y temperatura, así como durante el almacenamiento, en comparación con las enzimas libres. Los preparados inmovilizados retuvieron aproximadamente el 80% de su actividad inicial después de 15 ciclos hidrolíticos.

Posteriormente, se utilizó el derivado inmovilizado con mayor rendimiento y actividad lipásica para ser aplicado en el diseño de un biosensor electroquímico – detector de triglicéridos. El biosensor se basó en la oxidación electroquímica del glicerol producido en la hidrólisis de triglicéridos catalizada por el derivado inmovilizado. La oxidación de glicerol fue catalizada por nanopartículas de óxido de cobre, soportadas sobre nanotubos de carbono de pared múltiple con el fin de mejorar la respuesta electroquímica, a los cuales se acopló el derivado inmovilizado. Se determinaron límites de detección y cuantificación aceptables y un amplio intervalo de trabajo comprendido entre 8.7μM hasta 1 mM.

El biosensor propuesto (Osuna Sánchez y col. 2014) exhibe una buena respuesta, estabilidad, reproducibilidad, repetitividad, bajo límite de detección y un buen intervalo lineal de concentraciones para la cuantificación de trioleína en solución amortiguadora de fosfato de pH 8. Así, se presenta como una herramienta promisoria para la determinación de triglicéridos.

 

Artículo PDF

 

 

CONCLUSIONES

Es relevante la importancia que han adquirido las lipasas debido a sus aplicaciones en diversos procesos.El empleo de lipasas inmovilizadas es la clave para el desarrollo de biosensores, en los cuales la enzimaesacoplada a un sistema electroquímico que funciona como un detector de triglicéridos. La aplicación de nanopartículas de metales y sus óxidos como catalizadores de la oxidación electroquímica del glicerol, generado en la reacción catalizada por lipasa, es  un campo poco explorado pero muy prometedor para el diseño de nuevos biosensores.

REFERENCIAS

Aloulou A, Rodríguez J A, Fernández S, van Oosterhout D, Puccinelli D y Carrière F. 2006. Exploring the specific features of interfacial enzymology y based on lipase studies. Biochim Biophys Acta 1761:995-1013.

Arévalo FJ, González-Techera A, Zon MA, González-Sapienza G y Fernández H. 2012.Ultra-sensitive electrochemical immunosensor using analytepeptidomimetics selected from phage display peptide libraries. Biosens Bioelectron 32:231-237.

Arévalo FJ, Granero AM, Fernández H, Raba J y Zon MA. 2011. Citrinin (CIT) determination in rice samples using a micro fluidic electrochemical immunosensor. Talanta 83:966-973.

Arya SK, Datta M y Malhotra B. 2008.Recent advances in cholesterol biosensor. Biosens Bioelectron 23: 1083–1100.

Balasubramanian K y Burghard M. 2006.Biosensors based on carbon nanotubes. Anal Bioanal Chem 385:452-468.

Basu I, Subramanian RV, Mathewa A, Kayasthac AM, Chadha A y Bhattacharya E. 2005.Solid state potentiometric sensor for the estimation of tributyrin and urea. Sens Actuators B107:418–423.

Baughman RH, ZakhidovAA y Heer WAD. 2002. Carbon nanotubes-the route toward applications. Science 297:787-792.

Belluzo MS, Ribone MÉ y Lagier CM. 2008. Assembling amperometric biosensors for clinical diagnostics. Sensors 8:1366-1399.

Ben Rejeb I, Arduini F, Amine A, Gargouri M y Palleschi G. 2007. Amperometric biosensor based on Prussian Blue-modified screen-printed electrode for lipase activity and triacylglycerol determination. Anal Chem Acta 594:1-8.

Boero C, Olivo J, Micheli GD y Carrara S. 2012. New approaches for carbon nanotubes-based biosensors and their application to cell culture monitoring. IEEE Trans Biomed Circuits Syst 6:479-485.

Bornscheuer UT, Bessler C, Srinivas R y Hari Krishna S. 2002. Optimizing lipases and related enzymes for efficient application. Trends Biotech 20:433- 437.

Castranova V, Schulte PA y Zumwalde RD. 2012. Occupational nanosafet y considerations for carbon nanotubes and carbon nanofibers. Accoun Chem Res 46:642-649.

Cesarino I, Moraes FC, Lanza MRV y Machado SAS. 2012. Electrochemical detection of carbamate pesticides in fruit and vegetables with a biosensor based on acetylcholinesterase immobilized on a composite of polyaniline-carbon nanotubes. Food Chem 135:873-879.

Contesini FJ, Lopes DB, Macedo GA, Nascimento MG y Carvalho PO. 2010. Aspergillus sp. lipase: Potential biocatalyst for industrial use. J Mol Catal B Enzym 67:163-171.

Dsouza SF. 1999. Immobilized enzymes in bioprocess. Curr Sci India 77:69–79.

Fernandes Gomes J, Batista Castelo de Paula F, Gasparotto LHS y Tremiliosi Filho G. 2012. The influence of the Pt crystalline surface orientation on the glycerol electro-oxidation in acidic media. Electrochim Acta 76:88-93.

Fernández PS, Martins ME y Camara GA. 2012. New insights about the electro-oxidation of glycerol on platinum nanoparticles supported on multi-walled carbon nanotubes. Electrochim Acta 66:180-187.

Foresti ML y Ferreira ML. 2004. Computational approach to solvent-free synthesis of ethyl oleate using Candida rugosa and Candida antarctica B Lipases. I. Interfacial activation and substrate (ethanol, oleic acid) adsorption. Biomacromol 5:2366-2375.

Foroughi MM, Beitollahi H, Tajik S, Hamzavi My Parvan M. 2014. Hydroxylamine electrochemical sensor based on a modified carbon nanotube paste electrode: application to determination of hydroxylamine in water samples. Int J Electrochem Sci 9:2955 – 2965.

Ganjali MR, Faridbod F, Nasli-Esfahani E, Larijani B, Rashedi H y Norouzi P. 2010. FFT Continuous cyclic voltammetry triglyceride dual enzyme biosensor based on MWCNTs-CeO₂ nanoparticles.Intern JElectrochemSci5:1422-1433.

Gao B, Xu T, Lin J, Zhang L y Su E. 2011. Improving the catalytic activity of lipase LipK107 from Proteus sp. by site-directed mutagenesis in the lid domain based on computer simulation. J Mol Cat B Enzym 68:286–291.

González-Bancerio J., Moreno-Medina VR y del Monte Martínez A. 2010. Lipases: enzymes having the potential for developing immobilised biocatalysts by interfacial adsorption. Rev Colom Biotecnol 12:113-140.

Granero AM, Fernández H, Agostini E y Zon MA. 2010. Amperometric biosensor based on peroxidases from Brassica napus for the determination of the total polyphenolic content in wine and tea samples. Talanta 83:249-255.

Grieshaber D., MacKenzie R., Voeroes J., Reimhult E. 2008.Electrochemical biosensors-sensor principles and architectures. Sensors 8:1400-1458.

Hasan F, Shah AA y Hameed A. 2006. Industrial applications of microbial lipases. EnzMicrobial Technol39:235-251.

Hossain MZ, Shrestha DS y Kleve MG. 2010. Biosensors for biodiesel quality sensing. J Arkansas Acad Sci 64:80-85.

Iliná A, Fernández H, Zon MA, Osuna Sánchez Y, Arévalo FJ, Sandoval Cortes J, Granero AM, Colunga Urbina EM, Segura Ceniceros EP, Martínez Hernández JL y Vettorazzi NR. 2014.  Biosensor electroquímico para la detección de triglicéridos basado en el uso de lipasas inmovilizadas en un sistema nanocompuesto en presencia de metales de transición o sus óxidos como catalizador de la oxidación electroquímica de glicerol. Patente: MX/a/214/008126 de 01/07/2014.

Jaeger KE. 2002. Lipases for biotechnology. Curr Opin Biotechnol 13:390–397.

Jainn R y Sharma S. 2012. Glassy carbonelectrodemodifiedwithmulti-walledcarbon nanotubes sensor for the quantification of antihistamine drug pheniramine insolubilized systems. J Pharmac Anal 2:56-61.

Kantak JB, Bagade AV, MahajanSA, Pawar SP, ShoucheYS y Prabhune AA.2011. Isolation, identification and optimization of a new extracellular lipase producing strain of Rhizopussp. Appl Biochem Biotechnol 164:969-978.

Knight K, Barros-Pimente MC, Camargo de Morais MM, Ledingham WM, de Lima Filho JL y Maia MM. 2000. Immobilization of lipase from Fusarium solani FS1. Brazil J Microbiol 31:220-222.

Kuo CH, Liu YC, Chang CMJ, Chen JH, Chang C y Shieh CJ. 2012. Optimum conditions for lipase immobilization on chitosan-coated Fe₃O₄ nanoparticles. Carbohydr Polym 87:2538– 2545.

Lee DH, Kim JM, Kang SW, Won J, Lee JW y Kim SW. 2006. Pretreatment of lipase with soybean oil before immobilization to prevent loss of activity. Biotechnol Lett 28:1965–1969.

Li H, Liu S, Dai Z, Bao J y Yang X. 2009. Applications of nanomaterials in electrochemical enzyme biosensors. Sensors 9:8547–8561.

Lianghua T, Liming X, Min S y Huaying G. 2007. Purification and application of a Lipase from Penicillium expansum PED-03. Appl Biochem Biotechnol 142:194-199.

Liao WY, Liu CC y Chou TC. 2008. Detection of triglyceride using an iridium nanoparticle catalyst based amperometric biosensor. Analyst133:1757–1763.

Lin MC, Lu CP, Cheng YR, Lin YF, Lin CS, y Lin G. 2007. Inhibition or activation of Pseudomonas species lipase by 1,2-ethylene-di-N-alkylcarbamates. Chem Phys Lipids 146:85-93.

Liu Y, Zhao Y, Sun B y Chening C. 2012. Understanding the toxicity of carbon nanotubes. Accoun Chem Res 46:702-713.

Lourenco LM y Stradiotto NR. 2009. Determination of free glycerol in biodiesel at a platinum oxide surface using potential cycling technique. Talanta 79:92-96.

Maruta AH y Paixão TRLC. 2012. Flow injection analysis of free glycerol in biodiesel using a copper electrode as an amperometric detector. Fuel 91:187-191.

Mead JR, Irvine SA y Ramji DP. 2002. Lipoprotein lipase: structure, function, regulation, and role in disease. J Mol Med80:753-769.

Moraes FC, Silva TA, Cesarino I, Lanza MRV, Machado SAS. 2013. Antibiotic detection in urine using electrochemical sensors based on vertically aligned carbon nanotubes. Electroanal 25:2092-2099.

Okafor C, Grooms D, Alocilja E y Bolin S. 2008. Fabrication of a novel conductometric biosensor for detecting mycobacterium avium sub sp. paratuberculosis antibodies. Sensors 8:6015-6025.

Osuna Y, Gregorio-Jauregui KM, Gaona-Lozano JG, de la Garza-Rodríguez IM, Ilyna A, Barriga-Castro ED, Saade H, López RG. 2012. Chitosan-coated magnetic nanoparticles with low chitosan content prepared in one-step. J Nanomater 2012:103

Osuna Sánchez Y. 2013. Inmovilización de lipasas en nanopartículas magnéticas para aplicaciones biotecnológicas. Tesis de Maestría en Biotecnología. Facultad de Ciencias Químicas de la U.A. de C.

Osuna Y, Gregorio-Jauregui KM, López G, Martínez JL, Saade H yIliná. 2013. Immobilization of Aspergillusniger  lipase on chitosan-coated magnetic nanoparticles using two covalent-binding methods. XV National Congress of Biotechnology and Bioengineering and 12th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms (GIM 2013), Cancún, QR, Mexico, June 23th- 28th, 2013.

Osuna Y, Sandoval J,Balvantín C, Segura P, Martínez JL, Saade H, López G, Colunga EM, Fernández H, Zon MA, Arévalo F y Ilyina A. 2013. Lipase immobilization on magnetic nanoparticles coated with chitosan to design nanostructured biosensor for triglycerides quantification. International Conference “BIOCATALYSIS.FUNDAMENTALS & APPLICATIONS. Biocatalysis-2013”. Moscow, Russia, 2-5 July, 2013.

Osuna Sánchez Y, Arévalo FJ, Zon MA, Sandoval Cortés J, Iliná Ay Fernández H. 2014. Desarrollo de un biosensor electroquímico para determinación de triglicéridos basado en un compósito de lipasa / magnetita- quitosano / nanopartículas de óxido de Cu / nanotubos de carbono.Memorias  de XXI Congreso de Sociedad Iberoamericana de Electroquímica, La Serena, Chile, 6-11 Abril, 2014.

Osuna Y, Sandoval S, Saade H, López RG, Martinez JL, Colunga EM, Segura EP, Arévalo FJ, Zon MA, Fernández H y Ilyina A. 2015. Immobilization of Aspergillus niger lipase on chitosan-coated magnetic nanoparticles using two covalent-binding methods. Bioproc Biosyst Eng 38:1437-1445.

Pereira EB, Sanín GM y Castro HF. 2003. Immobilization and catalytic properties of lipase on chitosan for hydrolysis and esterification reactions. Brazil J Chem Engin 20:343-355.

Perrotta PR, Vettorazzi NR, Arévalo FJ, Zon MA y Fernández H. 2012. Development of a very sensitive electrochemical magneto immunosesor for direct determination of ochratoxin An in red wine. Sens Actuat B Chem 162:327-333.

Pohanka M y Skládal P. 2008. Electrochemical biosensors – principles and applications. J Appl Biomed 6:57-64.

Prasek J, Drbohlavova J, Chomoucka J, Hubalek J, Jasek O, Adam V y Kizek R.2011. Methods for carbon nanotubes synthesis—review. J Mater Chem 21:15872-15884.

Prodromidis MI y Karayannis MI.2002. Enzyme based amperometric biosensors for food analysis. Electroanal 14:241-261.

Pumera M, Sánchez S, Ichinose I y Tang J. 2007. Electrochemicalnanobiosensors. Sens Actuat B Chem 123:1195–1205.

Pundiretal CS, Singh BS y Narang J. 2010. Construction of an amperometric triglyceride biosensor using PVA membrane bound enzymes. Clin Biochem 43:467–472.

Ranjbakhsha E, Bordbard AK, Abbasia M, Khosropoura AR y Shamsa E. 2012. Enhancement of stability and catalytic activity of immobilized lipase on silica-coated modified magnetite nanoparticles. Chem Eng J 79:272-276.

Reddy RRK, Chadha A y Bhattacharya E. 2001.Porous silicon based potentiometric triglyceride biosensor. Biosens Bioelectron 16:313–317.

Rodrigues DS, Mendes AA, Adriano WS, Gongalves LRB y Giordano RLC. 2008. Multipoint covalent immobilization of microbial lipase on chitosan and agarose activated by different methods. J Mol Catal B Enzym 51:100–109.

Rodríguez MC, Sandoval J, Galicia L, Gutiérrez S y Rivas GA. 2008. Highly selective determination of uric acid in the presence of ascorbic acid at glassy carbon electrodes modified with carbon nanotubes dispersed in polylysine. Sens Actuat B Chem 134:559-565.

Sangam VG y Patre BM. 2006. Performance evaluation of an amperometric biosensor using a simple microcontroller based data acquisition system. Int J Biol Life Sci 2:45-51.

Shin JH, Yoon SY, YoonI J, Choi SH, Lee SD, Nam H y Cha GS.1998. Potentiometric biosensors using immobilized enzyme layers mixed with hydrophilic polyurethane.SensActuatBChem50:19-26.

Silva JA, Macedo GP, Rodrigues DS, Giordano RLC y GonçalvesLRB. 2012. Immobilization of Candida antarctica lipase B by covalent attachment on chitosan-based hydrogels using different support activation strategies. Biochem Engin J 60:16-24.

Simoes M, Baranton S y Coutanceau C. 2010. Electro-oxidation of glycerol at Pd based nano-catalysts for an application in alkaline fuel cells for chemicals and energy cogeneration. Appl Catal B Environ 93:354-362.

Singh AK y MukhopadhyaM. 2012.Overview of fungal lipase: a review. ApplBiochemBiotechnol166:166486-520.

Solanki PR, Dhand C, Kaushik A, Ansari AA, Sood KN y MalhotraBD. 2009. Nanostructured cerium oxide film for triglyceride sensor. Sens Actuat B Chem 141:551–556.

Tehrani RMA y Ab Ghani S. 2012. Electrocatalysis of free glycerol at a nanonickel modified graphite electrode and its determination in biodiesel. Electrochim Acta 70:153-157.

Thomas A, Allouche M, Basyn F, Brasseur RyKerfelec B. 2005. Role of the lid hydrophobicity pattern in pancreatic lipase activity. J Biol Chem 280:40074–40083.

Tsai YC, Huang JD y Chiu CC. 2007. Amperometric ethanol biosensor based on poly(vinyl alcohol)–multiwalled carbon nanotube–alcohol dehydrogenase biocomposite. Biosens Bioelect 22:3051-3056.

ValentiniaF, Orlanduccia S, Terranovaa ML, Aminec A y PalleschiaG. 2004. Carbon nanotubes as electrode materials for the assembling of new electrochemical biosensors. Sens Actuat B Chem 100: 117-125.

Vijayalakshmi A, Tarunashree Y, Baruwati B, Manorama SV, Narayana BL, Johnson REC y Rao NM. 2008. Enzyme field effect transistor (ENFET) for estimation of triglycerides using magnetic nanoparticles. Biosens Bioelectron 23:1708–1714.

Wang J, Li M, Shi Z, Li N y Gu Z. 2002a. Direct electrochemistry of cytochrome c at a glassy carbon electrode modified with single-wall carbon nanotubes. Anal Chem Acta 74:1993-1997.

Wang S, Tan Y, Zhao D y Liu G. 2008. Amperometrictyrosinasebiosensorbasedon Fe₃O₄ nanoparticles-chitosannanocomposite. Biosens Bioelectron 23:1781-1787.

Wang ZH, Liu J, Liang QL, Wang YM y Luo G.2002b. Carbon nanotube-modified electrodes for the simultaneous determination of dopamine and ascorbic acid. Analyst 127 (5):653-658.

Xie W y Wang J. 2012. Immobilized lipase on magnetic chitosan microspheres for transesterification of soybean oil. Biomass Bioenergy 36:373-380.

Xie W y Wang J. 2014. Enzymatic production of biodiesel from soybean oil by using immobilized lipase on Fe₃O₄/Poly(styrene-methacrylic acid) magnetic microsphere as a biocatalyst. Energy Fuels28:2624 – 2631.

XieW y Ma N. 2009. Immobilized Lipase on Fe₃O₄ Nanoparticles as Biocatalyst for Biodiesel Production. Energy Fuels 23:1347–1353.

Yang R, Wei Y, Yu Y, Gao C, Wang L, Liu JH y Huang XJ. 2012. Make it different: The plasma treated multi-walled carbon nanotubes improve electrochemical performances toward nitroaromatic compounds. Electrochim Acta 76:354-362.

Zhang JH, Jiang YY, Lin Y, Sun YF, Zheng SP y Han SY. 2013. Structure-guided modification of Rhizo mucormiehei lipase for production of structured lipids. PLoS One8:10-13.

Zhang M, Smith A y Gorski W. 2004. Carbon nanotube−chitosan system for electrochemical sensing based on dehydrogenase enzymes. Anal Chem 76:5045-5050.

Zhao Q, Gan Z y Zhuang Q. 2002. Electrochemical sensors based on carbon nanotubes. Electroanal 14:1609-1613 (a).

Zhao Y, Zhang WD, Chen H y Luo QM. 2002. Anodic oxidation of hydrazine at carbon nanotube powder microelectrode and its detection, Talanta 58: 529-531.

Zhao Z., Jiang H. 2010. Enzyme-based electrochemical biosensors. INTECH Open Access Publisher, In: Serra PA (ed) Biosensors, Croatia.